基于“序列-结构-机理”的计算机辅助DAEase 新序列挖掘
摘 要：为丰富D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（D-allulose 3-epimerase, DAEase）家族成员，采用序列比对、同源建模、分子对接、蛋白表达、酶活检测等手段，建立了基于“序列-结构-机理”的计算机辅助 DAEase 挖掘新策略，成功筛选到 DAEase 新序列并对其进行表征。利用模板探针从 NCBI 数据库中筛选同源序列，根据对接质量、关键氨基酸数量、底物氢键个数及催化机理对候选序列进行综合评分；合成不同分值的 DAEase 候选序列进行表达验证，发现 2 个高分候选序列具备明显 DAEase 催化活性，而 3 个低分候选序列催化活性极低，与预测相吻合。对活性较高的来源于厚壁细菌（Firmicutes bacterium Bacillota bacterium）HGW 的 DAEase（Fbh-DAEase）进行表征，结果显示：Fbh-DAEase 为非金属离子依赖酶，其最适反应 pH 为 6.5；其最适温度为55 ℃，45、50、55 ℃的半衰期分别为 3.9、2.3 和 1.7 h；最适反应条件下 Fbh-DAEase 的比活力达到 254.3 U/mg。以 500 g/L D-果糖为底物时，Fbh-DAEase 催化反应 8 h 后 D-阿洛酮糖产量达到 137.8 g/L，转化率为27.56%。与现有 DAEase 相比，Fbh-DAEase 的比活力和热稳定性都达到较高水平，且最适 pH 为弱酸性，具有一定应用价值。
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